Lotta alla sepsi: diagnosi microbiologica rapida di infezione del torrente circolatorio
Infezioni · 16 maggio, 2023
AAVV
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Autori:
- Simona Barnini, Melissa Menichini, Cesira Giordano, Alessandra Vecchione, Serena Losacco, Alessandro Leonildi - Azienda ospedaliero-universitaria pisana
- Fabrizio Gemmi - Agenzia regionale di sanità della Toscana
La sepsi, sindrome clinica caratterizzata da risposta fisiopatologica disregolata a un’infezione, costituisce una delle maggiori preoccupazioni per la Sanità pubblica: l’incidenza della patologia appare in aumento, probabilmente per l'invecchiamento della popolazione con più patologie, per un miglioramento dell’attenzione dei clinici e per un incremento delle capacità diagnostiche dei laboratori. Anche se la reale incidenza non è nota, è considerata una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Oltre a essere la principale causa di morte nei pazienti ricoverati in area intensiva, coloro che sopravvivono alla sepsi spesso esitano in disabilità fisiche, psicologiche e cognitive a lungo termine1.
L’inizio della terapia antibiotica empirica ragionata entro la prima ora dal sospetto clinico di sepsi riduce il tasso di mortalità, ma può avere effetti negativi come l'aumento di patogeni multiresistenti. Pertanto, per curare efficacemente i pazienti settici, è necessario disporre prima possibile dell’identificazione eziologica e del profilo di suscettibilità antimicrobica. Sono state sviluppate diverse metodiche di laboratorio per l’identificazione rapida dei microrganismi nelle emocolture, accorciando notevolmente i tempi rispetto alle metodiche convenzionali. L'uso di tecnologie in grado di rilevare rapidamente la resistenza antimicrobica negli isolati batterici ha la possibilità di ridurre la durata del trattamento empirico, passando precocemente a una terapia mirata.
Quindi, anche per la sepsi, come per tutte le patologie tempo-dipendenti, il tempo e la precisione diagnostica si trasformano in chance di sopravvivenza e minor rischio di disabilità per i pazienti: il concetto non è nuovo per questa rivista2,3,4.
La Regione Toscana, nel 2018, ha definito un’organizzazione con un coordinamento generale e una rete di competenze diffuse nelle aziende sanitarie e negli enti regionali (Rete AID - Antimicrobial stewardship, Infection control e Diagnostic stewardship)5 e, nel 2020, ha normato le caratteristiche della Rete regionale dei laboratori di microbiologia, dotati di caratteristiche di efficienza operativa, tecnologia e competenze ancora in gran parte non implementate6, mentre il Gruppo tecnico regionale per la lotta alla sepsi ha prodotto, nel 2019, un documento di indirizzo (in corso di aggiornamento) delineando le strategie per “aprire la visuale”, “impostare una strategia integrata per gestire l’incertezza” e “agire tempestivamente”.
La SOD Microbiologia batteriologica dell’Azienda ospedaliero-universitaria pisana ha avviato già dal primo dicembre 2020 l’attività diagnostica continuativa (24 ore su 24, 7 giorni alla settimana): su questa rivista mette a disposizione degli operatori sanitari un breve filmato e un testo di sintesi dove sono descritte le modalità operative adottate per la diagnostica microbiologica rapida.
1. Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, Shankar-Hari M, Annane D, Bauer M, Bellomo R, Bernard GR, Chiche JD, Coopersmith CM, Hotchkiss RS, Levy MM, Marshall JC, Martin GS, Opal SM, Rubenfeld GD, van der Poll T, Vincent JL, Angus DC. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 2016 Feb 23;315(8):801-10. doi: 10.1001/jama.2016.0287. PMID: 26903338; PMCID: PMC4968574.
2. Infezioni Obiettivo Zero. Identificazione precoce della sepsi nell’emergenza territoriale
3. Infezioni Obiettivo Zero. Identificazione del paziente con sospetta sepsi al Dipartimento di emergenza
4. Infezioni Obiettivo Zero. Sepsis stewardship, antibiotic stewardship e percorso microbiologico
5. Regione Toscana, 2018. Delibera n. 1439. Approvazione linee di indirizzo per un approccio integrato alla prevenzione e contrasto alle infezioni correlate all'assistenza, all'antimicrobicoresistenza e alla sepsi
6. Regione Toscana, 2020. Delibera n. 74. Riorganizzazione delle attività dei Laboratori di microbiologia clinica: realizzazione della nuova Rete regionale di microbiologia clinica.
7. Gruppo tecnico regionale per la lotta alla sepsi (2019). Call to action.
Diagnosi microbiologica rapida di infezione del torrente circolatorio
Nel primo anno di attività H24, 7 giorni su 7, dal 1°dicembre 2020 al 30 novembre 2021, nel nostro Laboratorio sono pervenuti 44.051 flaconi per emocoltura; di questi, 6.137 sono stati segnalati come positivi dagli incubatori a monitoraggio continuo. Tra i flaconi positivi, 1.562 sono stati selezionati per la procedura diagnostica rapida, secondo questi criteri:
a) Campione prelevato ad un paziente segnalato dal reparto di degenza come critico.
b) Primo campione positivo, alla colorazione di Gram, per batteri Gram negativi, o per batteri Gram positivi in catenelle, oppure batteri Gram positivi in ammassi, questi ultimi con tempo di positività del flacone inferiore a 13-15 ore (mediana dei tempi di positività di campioni di emocolture con Staphylococcus aureus, stimati nel nostro laboratorio) o altri microrganismi che possano essere responsabili di infezioni del torrente circolatorio (per decidere se procedere con la diagnostica rapida si può consultare il reparto e/o i dati ematochimici del paziente).
I dati relativi al paziente vengono controllati sul programma gestionale di laboratorio, mediante il quale è possibile consultare anche le analisi correlate, come emocromo, procalcitonina, altri esami di Microbiologia, etc. I dati relativi alla emocoltura positiva vengono invece registrati, oltreché sul gestionale, su un registro cartaceo, dove si riportano: il barcode del campione con i dati del paziente, il risultato dell’esame microscopico, l’esito della procedura diagnostica rapida, corredato dei risultati dei test molecolari per fattori di resistenza agli antibiotici qualora la specie individuata fosse fra quelle che frequentemente li presentano*, i dati dell’operatore a cui si sono riferiti telefonicamente gli esiti delle indagini, l’orario della chiamata e il nome di chi ha eseguito la procedura.
La procedura diagnostica rapida viene eseguita in questo modo: i campioni che risultano monomicrobici all’osservazione microscopica vengono sottoposti all’identificazione rapida da flacone utilizzando lo strumento di spettrometria di massa MALDI-TOF. Brevemente, 8 ml di emocoltura vengono inoculati in un Serum Separator Tube e centrifugati a 2000 RCF per 10 min. Il pellet batterico viene raccolto e sottoposto ad un lavaggio in acqua distillata, seguito da una centrifugazione a 16.200 RCF per 2 min, per eliminare le emazie residue. Per i batteri Gram negativi il pellet così lavato viene depositato sull’apposita piastra metallica e ricoperto da 1 µl di matrice HCCA (acido alfa-ciano-4-idrossicianico) per l’identificazione mediante MALDI TOF-MS. Per i batteri Gram positivi, dopo la deposizione del pellet sulla piastra metallica, viene eseguito un ulteriore breve passaggio di estrazione proteica, aggiungendo 1 µl di acido formico al 70% e 1 µl di matrice HCCA. Ad asciugatura avvenuta, la piastra metallica viene inserita nello spettrometro e si esegue l’analisi, che può essere condotta sia in modalità automatica che manuale, dirigendo il laser dello strumento nelle zone che appaiono cristallizzate in modo ottimale (1, 2). L’intero procedimento si compie in circa 20 minuti, con costi irrisori in termini di materiali e con elevatissima concordanza dei risultati dell’identificazione con quelli ottenuti dalla coltura tradizionale della emocoltura positiva su terreno solido (circa 99% per le emocolture monomicrobiche).
Per i campioni che risultano polimicrobici all’esame microscopico, possono essere eseguiti pannelli molecolari (i cosiddetti pannelli sindromici, con diversi target).
*vengono eseguiti test molecolari in PCR real time per la ricerca di KPC, NDM, VIM, OXA-48, IMP, MRSA, VAN A e VAN B.
1. Barnini S, Ghelardi E, Brucculeri V, Morici P, Lupetti A. Rapid and reliable identification of Gram-negative bacteria and Gram-positive cocci by deposition of bacteria harvested from blood cultures onto the MALDI-TOF plate. BMC Microbiol. 2015 Jun 18;15:124. doi: 10.1186/s12866-015-0459-8. PMID: 26084329; PMCID: PMC4471905.
2. Giordano C, Piccoli E, Brucculeri V, Barnini S. A Prospective Evaluation of Two Rapid Phenotypical Antimicrobial Susceptibility Technologies for the Diagnostic Stewardship of Sepsis. Biomed Res Int. 2018 May 10;2018:6976923. doi: 10.1155/2018/6976923. PMID: 29862284; PMCID: PMC5971348.